未熟さは怖いもの知らず　
直感で新発見への最短コースを目指す　
若い科学者の特権です　
　
理研は若い科学者管理に未熟でした　
STAP細胞の存在は　不明
　

■STAP細胞

50年前か　大学でのある薬品の定量分析方法開発のお手伝い　 いくつかの実験方法を先生に指示された　 未熟さで怖いもの知らず　頼りない直感で最短コースを目指す　 運よく結果は成功　 ただし後から先生に　いくつかの追試や周辺の確認実験を指示されました　 良い経験をしました

先生が花を持たせてくれ　 一部を卒論に利用させていただきました

社会人になり事前調査の大事さを知り　 お金を使う前の　頭の中での思考実験が習慣になりました　 思いつく 可能性から開発開始　 それでも多くの失敗を経験しました

未熟さゆえの大胆さ　捨てたものではありません　 発想が膨らみ　時には破裂　痛い目にも会うでしょう　 爆発　 新発見に到達するかもしれません

指示されたとおりに　一つ一つこなす愚直さも大事です　 多分発想の膨らませ方は身につかないでしょう　 指導者には向いています

若い科学者にも二つのタイプ　 いずれも大事な人材と許容される環境が大事ですが　 放任野放し放し飼いは別世界です

もしかして若い科学者一人の首を獲って　　 組織の体をなさない理研は　幕引きにしたいのかも

後からSTAP細胞の存在が実証されたたら面白いですね　 私は期待派です

●「疲れた」小保方氏らに遺書　理研・笹井氏自殺 (2014/8/5) 　 自殺を図ったとみられる理化学研究所発生・再生科学総合研究センターの笹井芳樹副センター長(52)が、小保方晴子氏ら理研関係者に遺書を書いていたことが関係者への取材で分かった。「疲れた」という趣旨や謝罪する内容が書かれていたという。 　 兵庫県警によると、笹井氏は５日朝、発生・再生科学総合研究センターに隣接する先端医療センター研究棟の4階と5階の間の踊り場で、ひものようなもので首をつった状態で見つかった。 　 遺書は近くのかばんの中にあった。小保方氏に宛てた遺書には「あなたのせいではない」「ＳＴＡＰ細胞を必ず再現してください」という趣旨のことも書かれていたという。

●小保方＆笹井氏“師弟コンビ”と若山教授の複雑な人間関係… (2014/4/21) 　 責任のなすりつけ合いの様相を呈している新型万能細胞「ＳＴＡＰ細胞」論文不正問題は、登場人物たちの複雑な人間関係も透けて見えてくる。理化学研究所の小保方晴子研究ユニットリーダーと上司の笹井芳樹氏の“師弟コンビ”と、理研を離れた山梨大の若山照彦教授との間に、微妙な距離感が生まれているとも伝わる。ＳＴＡＰ現象は何だったのか。共著者間の足並みが崩れ、肝心のナゾは深まる一方だ。 　 「論文の80の実験のうち75は、若山研究室で、小保方さんと若山さんが中心に行われたもの」 　 16日に行われた会見で何度も「若山さんが…」と繰り返した笹井氏。まるで責任の所在が若山氏にあるかのような印象を与えた会見だったが、科学ジャーナリストの大朏(おおつき)博善氏は「笹井氏は、若山氏の“矛盾”を指摘したかったのだろう」とみる。 　 若山氏は、小保方氏が作製した「ＳＴＡＰ細胞」を、マウスの胚に入れる方法でキメラマウスを作る段階を担当。論文問題が発覚後、「自分がやった実験が何だったのか、分からなくなった」と述べ、小保方氏から受け取った「ＳＴＡＰ細胞」の“本性”が信用できなくなったとして論文取り下げを表明した。 　 大朏氏は「若山氏は『分からなくなった』と言っているが、小保方氏は2011年春から、当時、理研にいた若山氏の研究所で実験を行っていた。小保方氏から、どういう形で、ＳＴＡＰ細胞が若山氏に渡ったのか。ポイントとなるこの点については何も語られていない。笹井氏もそこを疑問に感じているのではないか」とみている。 　 一方で、笹井氏の発言には「若山氏に責任をなすりつけた」と批判が多い。両者にはそもそも温度差があったと指摘する関係者もいる。 　 「若山氏は茨城大の農学部出身であり、世界ではじめてクローンのマウスの作製に成功したのも、優良種の効率的な生産という畜産界の発展を目指していた。しかし、万能細胞は、再生医療目的が主流。再生医療のトップランナーである京大卒の笹井氏については『笹井さんはエリートなので…、私には分からないようなことをやっている』などと話すこともあって、コンプレックスを抱いていたようだ」(両者を知る関係者) 　 2人は科学者としての立ち位置も異なり、「仮説を立てて立証していくのが研究者とすれば、研究用マジックハンドの名手である若山氏は技術者に近かった。笹井氏は若山氏を軽くみていたようなところがあり、笹井氏が会見で『世界の若山』と言ったときは、両者の関係を知っている人は笑っていた」(別の関係者)。 　 若山氏と小保方氏の関係も微妙だ。小保方氏は14日に若山氏に反論するようなコメントを出したが、「若山さんは研究室で『センセー、センセー』とすり寄ってくる小保方さんを、そもそもよく思っていなかった」という話もある。 　 小保方、笹井両氏が会見で“弁明”を繰り返したのに対し、笹井氏の会見後に「共著者の一人として自責の念を覚える」とのコメントを発表し、言い訳は行っていない若山氏。 　 騒動後には、体調を崩し、研究室にも姿を現していないという情報もある。生真面目な若山氏が一人割を食うようでは気の毒でならない。

　
2014/4 -2014/12/19　
　

●記者会見 (2014/12/19)

●「検証実験は、来年3月までとしていましたが、この時点で終了することとしました」 　 《ＳＴＡＰ細胞は、あるのか、ないのか−。細胞の有無を確かめる検証実験の結果に関する理化学研究所の会見が19日午前、東京都港区で始まる》 　 《ＳＴＡＰ細胞を作製したとする論文を発表した理研の小保方(おぼかた)晴子氏は、会見場に姿を見せないという。「疲労が激しく心身の状態が悪い」。理研はそう説明している》 　 《小保方氏は7月から第三者の立ち会いの下で、論文と同じ手順で検証実験を始めていた。だが…。細胞を作り出すことはできずＳＴＡＰ細胞は存在しない可能性が高まっている》 　 《会見場には、研究不正再発防止改革推進本部検証実験チームのリーダーを務める相沢慎一氏、副チームリーダーの丹羽仁史氏、研究員の清成寛氏と、理研理事の坪井裕氏が姿を見せる予定だ》 　 《理研はどのような説明を行うのか。問題の発端となった小保方氏の論文は今年1月に発表された。新型の万能細胞の発見を、にこやかな笑顔で説明する小保方氏は、一躍時の人となり“リケジョ”ブームに火を付けた》 　 《だが、画像データなどについて次々と問題が指摘されると、状況は一変。小保方氏に疑惑の目が向けられた。それでも、4月の会見で小保方氏は強気の姿勢を崩さなかった》 　 「ＳＴＡＰ細胞はあります」 　 「(作製に)200回以上成功した」 　 《そう説明していた小保方氏だったが、理研は捏造(ねつぞう)と改竄(かいざん)の不正を認定。論文は7月に撤回され、科学的な根拠は失われた》 　 《さらに、小保方氏が関与しない形で進められた理研の検証チームも、8月の中間報告で「細胞は作ることはできなかった」と発表している》 　 《それでも、代理人の弁護士は「小保方氏は現在もＳＴＡＰ細胞があると考えていると思う」と述べている。検証チームの最終的に導き出した結論は、どうなるのか。注目の会見が、いよいよ始まる》 　 相沢氏「まず結論を述べさせていただきます」 　 「4月から8カ月、小保方研究員によって9月より3カ月検証実験を行ってきましたが、ＳＴＡＰ現象を再現することはできませんでした」 　 「検証実験は、来年3月までとしていましたが、この時点で終了することとしました」 　 《こう言い切った相沢氏は、小保方氏の検証実験の内容について細かい説明に入った。どのような実験を行ってきたのかを専門用語を駆使して話す相沢氏は、ＳＴＡＰ細胞が科学界から評価を得たことにも触れた》 　 相沢氏「科学界で注目を集めたのは、いわゆるキメラマウス、多分化細胞が得られることだった」 　 《ただ、検証実験では注目を集めた論文の内容とは大きく食い違う結果が出たという。続いて、小保方氏とは別に検証実験を行った丹羽氏も、ＳＴＡＰ現象の確認は得られなかった状況を指摘した》 　 《丹羽氏の説明終了を受け、相沢氏はこう結論づけた》 　 相沢氏「これ以上の実験を続けることは検証の範疇(はんちゅう)を超えている。検証実験は終了する」

●ＳＴＡＰ細胞は存在するのか「発見される可能性があるか、ないと考えるか、は研究者の判断」 　 《研究不正再発防止改革推進本部検証実験チームのリーダーを務める相沢慎一氏が検証実験の終了を宣言した後、理研の坪井裕理事が突然、小保方(おぼかた)晴子氏の進退について切り出した》 　 「小保方研究員ですが、12月21日付で退職したいとの願いが15日に提出されました。本人の意思を受け止め、認めることにいたしました」 　 《理研の職員が報道席に小保方氏のコメントを記した用紙を配り始めた。会場に詰めかけた報道陣はざわめき、コメントを配布する理研の職員は、けたたましくたかれた無数のスチールカメラのフラッシュを浴びる》 　 《記者の手元に届いた用紙をみると、コメントはパソコンを使って書かれたとみられる簡素な文章だった》 　 「どのような状況下であっても必ず十分な結果をと思い必死に過ごした3か月でした。予想をはるかに超えた制約の中での作業となり、細かな条件を検討できなかった事などが悔やまれますが、与えられた環境の中では魂の限界まで取り組み、今はただ疲れ切り、このような結果に留まってしまったことに大変困惑しております」 　 《コメントを一読する時間を置かれた後、報道陣との質疑応答が始まった》 　 −−小保方氏は200回以上成功したといっていたが、なぜそのやりかたでＳＴＡＰ細胞は発見されなかったのか。 　 相沢氏「緑色蛍光を発するような事例は検証実験でも40回以上は出ています。小保方氏のいう200回以上の再現が成り立つというのは成り立つかもしれないが…」 　 《ＳＴＡＰ細胞の発見は真実なのか、偽りなのか−。理研側の解答は歯切れが悪い》 　 −−小保方氏は、ＳＴＡＰ細胞を作り出すには独自のコツがあると発言していた。そのコツは明らかになったか 　 相沢氏「明らかになっていません」 　 《報道陣からは、この日会見には出席していない小保方氏の様子について質問も飛んだ》 　 −−小保方氏は検証結果に納得しているのか 　 相沢氏「その質問に答えることは、私からはとても難しくて、正確に答えることはできない。彼女自身はこの結果に困惑しているのが現状で、なぜこの結果にとどまったかについて困惑していて、受け止められるような状態ではないと…、これは私の推察です」 　 −−小保方氏は現在もＳＴＡＰ細胞はあると考えているのか 　 相沢氏「それには答えられません」 　 −−そもそも、ＳＴＡＰ細胞は存在するのか 　 相沢氏「存在するかどうか、科学者として答えることはできない。科学者として答えられるのは、(検証実験では)再現することができなかったということだ」 　 《では、今後ＳＴＡＰ細胞が発見される可能性はあるのだろうか。そんな報道陣からの質問に、相沢氏は「さて、困りましたね…」と苦笑しつつ、こう答えた》 　 「今回の検証実験では、ＳＴＡＰ細胞を再現することはできなかった。それから可能性を見いだすか…、もはや可能性はないと考えるかは、それぞれの研究者の判断ではないか」 　 《質問は、検証実験の状況にも及んだ。小保方氏のコメント中には「予想をはるかに超えた制約の中での作業となり」との表現があるからだ》 　 −−検証実験の様子は公開されるべきではないか 　 坪井「(検証は)第三者の立ち会いの下で、ということもあり、公表しないという前提で協力を得ているということもある。また監視カメラも設置したが、映像(の公開)は情報公開法になじまないと承知している」 　 《会見場では、まだ多くの報道陣が質疑を求め手を上げ続けている》

●「ＳＴＡＰ論文のデータは何だったのか」理研は回答に窮し… 　 《ＳＴＡＰ細胞の検証実験結果に関する理化学研究所の会見。検証実験チームのリーダーである相沢慎一氏、副チームリーダーの丹羽仁史氏らと報道陣との質疑応答が続いている。ここでＳＴＡＰ細胞の特許出願について質問が出た》 　 −−ＳＴＡＰ細胞の特許出願については今後どうするのか 　 相沢氏「細胞の特許出願は放棄することも含めて検討したい」 　 《会見では、小保方氏が退職願を提出し、理研が受理したことも明らかにされた。報道陣からは、その退職願についても質問が飛んだ》 　 −−会見に本人(退職の意向を示した小保方氏)は出席したがっていたのではないか 　 相沢氏「(会見は)実験結果を発表する場で、一メンバーについて発表する場でない。基本的に私と丹羽氏の判断を報告する場で、彼女の出席は求めませんでした」 　 《相沢氏ははっきりとした口調で淡々と質問に答えていく》 　 −−小保方氏から「(会見に)出席したい」との申し出はなかったのか 　 相沢氏「出席させてほしいとの要望はありません。 　 《小保方氏の論文2本は今年1月、英科学誌「ネイチャー」に掲載され、世界的に注目を集めた。その論文について、記者の追及が始まった》 　 −−ネイチャーに掲載された論文にはＳＴＡＰ細胞のデータが載っている。このデータは何だったのか 　 《会見場が静寂に包まれる。理研側は答えに窮しているようだ》 　 相沢氏「申し上げられることはＳＴＡＰ細胞の再現ができなかった。そういう結果だったということです。検証チームとしては答えることは難しいです。個人的な感想ならいくらでも申し上げられるが…」 　 《記者は一研究者としての見解を求めたが、相沢氏は「個人としての意見を述べることは差し控えたい」として回答しなかった》 　 《『ＳＴＡＰ細胞はあります』。力強くそう語った4月の会見以来、公の場に姿を見せていない小保方氏。現在はどのように過ごしているのかについても、質問は及んだ》 　 −−(小保方氏の)最近の様子は 　 相沢氏「それは分かりません。4日前(12月15日)の実験データの整理までは出てきていました。今週は調査委のヒアリングを受けるのに出勤していました」 　 −−15日に(小保方氏に)会ったときはどんな様子だったか 　 相沢「主観的なものになるので差し控えます。本人とは昨日(18日)会いました」 　 《相沢氏は、小保方氏の様子について聞かれると、かたくなに口をつぐんだ》 　 《質問はさらに続き、相沢、丹羽両氏の責任追及が始まった》 　 −−相沢さん、丹羽さんの責任についてはどう考えるか 　 相沢氏「責任を感じています。ただ、責任のことをどうこう言うのは今日は適当ではありませんので、別の場所で処理したいと思います。今日は検証実験のことのみ答えたいと」 　 丹羽氏「調査委の結果を待って判断したいと思います」 　 《論文に疑義が認められたことで小保方氏は現在、懲戒委員会で処分が検討されている。退職届はその最中に提出された》 　 坪井裕理事「理研職員でなくなっても、調査結果が出た後に(懲戒委員会は)再開します。どういう処分が相当かを検討することになると思います」 　 《続いて、小保方氏の退職願に関する質問があった。小保方氏は退職願の中で、検証実験が『予想をはるかに超えた制約の中での作業』と表現した。この文言について質問が出る》 　 −−小保方氏にとっては(そうした環境での実験は)不本意だったのではないか 　 相沢氏「本人(小保方氏)も同意しています。それ以外の条件の下で実験をやることは検討されませんでした」 　 《相沢氏が続ける。いらだっているのか、強い口調でこれまでより声が大きくなった》 　 相沢氏「大きな制約はあった。実験はモニターのある部屋に限られ、解析は他の人に委ねないといけませんから」 　 −−小保方氏は会見の場も設けられないまま理研を去るという結果になるが 　 相沢氏「制約はあったと思います」 　 《相沢氏はそう述べ、質問に対する回答を終えた》

●懲戒処分対象なのに退職願受理「なぜ非常識なことを」記者の追及に理研「これ以上の負担は…」 　 《ＳＴＡＰ細胞の有無を確かめる検証実験に関する理化学研究所の会見は開始から1時間以上が過ぎたが、報道陣との質疑応答が続いている。理研側は冷静に対応することが多かったが、小保方(おぼかた)晴子氏の退職についての質問に対しては、いらだった様子を見せることもあった》 　 −−小保方氏は懲戒処分が検討されているはずだ。一般企業などでは、懲戒処分対象者から退職願を受け取らない。なぜそういった非常識なことをするのか。また、小保方氏に退職金は出るのか 　 坪井裕理事「まず、後段の(質問の)ほうですが、小保方氏は任期制の職員なので、懲戒退職だろうと依願退職だろうと、退職金というものがありません」 　 坪井氏「なぜ退職願を受け取ったのかですが、これは野依(良治)理事長のコメントと重なります。小保方氏は10カ月あまり心労が重なっている。受理しないといった場合の、これ以上の負担はかけられないと判断しました。今後、懲戒委員会は再開し、退職したあと、どういった処分が相当か検討はしていきます」 　 《野依氏は小保方氏の退職を承認したことに関するコメントで「これ以上心の負担が増すことを懸念し、本人の意志を尊重することとしました」としている。理研側の回答に対し、質問した記者は納得できないのか、さらに追及を強めた》 　 −−退職者は処分できないではないか 　 坪井氏「処分が相当かどうかの判断になります。繰り返しになりますが、これ以上の負担をかけないために…」 　 −−そういうことが、理研の体質が、一般の感覚と離れているといわれている。そのことについてどう思うのか 　 坪井氏「いろいろなご意見があると思いますが…」 　 《坪井氏の声と、質問する記者の声が重なりあい緊張した雰囲気に包まれる。理研側は処分の問題は後ほど話すとし、検証結果に関する質問だけを求める》 　 《理研側の要請を受け、質問は再現実験に関するものに集中した。ＳＴＡＰ細胞をめぐる実験では、若山照彦山梨大教授がキメラマウス作製に成功し、万能細胞であることを立証したことになっており、その点について質問があった》 　 −−再現実験の際、キメラマウスはどのように用意したのか 　 検証実験チームの相沢慎一リーダー「キメラマウスの作成を若山先生にお願いしました。しかしながら、先生は大学の業務が多忙で残念ながら検証実験に協力する時間はないということでありました。そういう意味では、若山先生だけのトリックがある可能性を全く否定することはできません。ただ、若山先生は非常に高度な技術を持っていらして、そのもとでいろいろに工夫されて行われた実験はそれなりの意味を持っていたと認識しています」 　 −−若山先生の協力を得られなかったというのは、聞き取り調査なども協力を得られなかったのか 　 相沢氏「聞き取りで得られる情報はすでに知っています。もし残っているとするならば、実際にデモンストレーションをしていただいて、どうかということは残されていますが、それはお忙しいのでかなわないということです」 　 《さらに報道陣から、細胞の酸処理について、どの薬品を使ったのかについてや、論文に記載された通りの方法で行われたのかなど専門的な質問が投げかけられた》 　 −−このような結果になってしまったことについてどう思うか 　 検証実験チームの丹羽仁史・副リーダー「科学は性善説です。私は最後のほうに研究に加わったわけですが、それ以前に小保方さん、若山先生たちが出したデータがあります。そこに問題があったかもしれない。でも、だからといって、共同研究者が出したデータを信じずに、一から自分でやり、さらにＳＴＡＰ細胞ができないという答えを出すことが科学にふさわしいかというと、何とも判断がつかない」 　 《一点を見つめる丹羽氏の表情は苦悩にあふれていた》

●「犯罪人扱いの検証あってはならぬ」　会見終了後、突然の強い訴え 　 《ＳＴＡＰ細胞の有無を確かめる検証実験の結果に関する理化学研究所の会見は報道陣からの質問が途切れることはなく、さらに続いている》 　 《検証実験からはＳＴＡＰ現象は再現されず、論文を執筆した小保方(おぼかた)晴子氏は退職を願い出て了承されたという。論文と検証実験の大きなずれは何を意味するのか。なぜこのような論文が出されたのか。その点について記者の質問が飛んだ》 　 −−どうすれば論文の信頼性を担保できるのか 　 検証実験チームの丹羽仁史・副チームリーダー「例えば第三者が再現を行ったと聞いたとして、第四者、第五者が検証しなければならないのか」 　 丹羽氏「無限に続いてしまう。どこで線引きをするのか。やはり科学者本人の良心とお互いの信頼関係になると思う」 　 −−論文を検証している調査委員会の見解はいつでるのか 　 坪井裕理事「外部の委員会なので、スケジュールは把握していない」 　 《検証や論文に関する細かい質問が続く中、終了予定の午後0時半に近づいた。時間が迫っていると考えたのか、報道陣は本当にＳＴＡＰ細胞はないのかなど、核心に迫る質問を投げかけた》 　 −−期限を待たずに検証実験は終了したが、予定の1300万円の研究費は使い果たしたのか 　 坪井氏「1300万円は当初1年間の予定だった。ただ、小保方氏の参加は加味せず、(研究室の)改修費用が必要になった。1500万円かかった」 　 −−ＳＴＡＰ細胞はなかったのか 　 検証実験チームの相沢慎一チームリーダー「ＳＴＡＰ細胞の定義は広い。ただ最も科学的に評価されたキメラマウスなどを作るような能力はなかった」 　 −−つまりＳＴＡＰ細胞はなかったのか 　 相沢氏「満たすものはなかった」 　 −−(小保方氏は)辞表は直接、(理研の)神戸事業所長に手渡したのか 　 坪井氏「はい」 　 《理研側は質問に淡々と答えていく》 　 −−論文に不正疑惑が生じた場合に、論文とは異なる条件の下で検証実験をする意義について、どう考えているのか 　 相沢氏「今回はＳＴＡＰ現象が再現できるのかを検証した。ただ、基本的には論文の書いていることを検証した。個々のケースで異なるが、今度の場合では理研として重要な意義を持つとして検証した」 　 丹羽氏「一つの条件で、できない時にあきらめるのか。本人から最も効果的に得られる方法を聞き、検討する上で、論文に記載がないが、やることに一定の科学的妥当性はあった」 　 《会見の終了予定時間である午後0時半を過ぎたが、質問は終わらず、会見は続いている》 　 −−小保方氏は3カ月の間に何度、再現実験をしたのか 　 相沢氏「正確に数えていないけれども、週に4日をやっていて…」 　 坪井氏「9月16日〜11月29日まで50日間行っております」 　 《相沢氏もうなずきつつ「少なくとも45回以上はやっている」と述べた》 　 −−ＳＴＡＰ細胞は万能細胞ともいわれるが、ここで研究を中止するのか 　 相沢氏「検証実験としては終了する、個々の研究者が個々の研究として研究する。あくまでも検証実験として終了する」 　 《ＳＴＡＰ細胞が再現できなかったとの結果を、小保方氏に伝えた際の様子についての質問に、相沢氏が逆質問した》 　 相沢氏「それは泣き出したかとか、そういうことですか？」 　 《相沢氏は苦笑しながら聞き返す。そして、「泣いてはいませんでした。そのときは」と答えた》 　 《まだ質疑を求める挙手は多かったが、司会者が会見を打ち切った。無数のカメラのフラッシュを浴びながら、理研側の出席者らは退席した》 　 《会見終了後、いったん退席しようとした相沢氏が再びマイクを握った》 　 相沢氏「検証実験を、モニターを置いたり、立会人を置いたりして行うのは、科学のやり方ではない」 　 相沢氏「科学のやり方は、科学のやり方で処理しなければいけないので、そういうふうな検証実験をしてしまったことに対して、責任者としてものすごい責任を感じている」 　 《相沢氏は強い調子で報道陣に訴えかけた。小保方氏による再現実験は、立会人や監視カメラなど“視線”にさらされる中で行われていた》 　 相沢氏「今後何かあるたびに、このように犯罪人扱いしたような形で、科学の行為を検証することは、科学にあってはならないことだと思っています。深くおわびを申し上げるとともに、責任を痛感しております」 　 《相沢氏は思いの丈を述べると、会場を去っていった》

●“ＳＴＡＰ細胞作製できず”に複雑な反応 　 ＳＴＡＰ細胞の問題で理化学研究所は19日に会見し、小保方晴子研究員本人が細胞の作製を試みたもののＳＴＡＰ細胞を作ることはできなかったと正式に明らかにしました。 　 これで理化学研究所が行うＳＴＡＰ細胞の検証実験はすべて打ち切られることになり、検証実験や研究に携わった関係者などからは複雑な声が上がりました。 　 ●相澤チームリーダー「科学のやり方ではない」 　 論文を書いた本人が実験をしてもＳＴＡＰ細胞を作り出すことができなかったのに、論文にＳＴＡＰ細胞が出来たことを示す大量のデータがあるのはなぜかという質問に対し、検証チームの責任者を務めた相澤慎一チームリーダーは、しばらく沈黙したあと「われわれはＳＴＡＰ細胞の再現実験を請け負っただけなので、その結果、再現できなかったとしか話せない。かけ離れたデータが論文に掲載されているのはどういうことによるのか答えることはできない」と述べました。 　 さらに1人の科学者としての見解を聞かれても「この場では答えを差し控えたい」として自らの見解は示しませんでした。 　 一方で相澤チームリーダーは会見終了後に、みずからマイクを持ち「小保方研究員にカメラや立会人を置いて検証実験をするというのは科学のやり方ではない。犯罪者扱いのようにやることは科学としてあってはならないことだ。責任者として深くおわびを申し上げるとともに、責任を感じております」と述べ、今回の検証実験の進め方を批判しました。 　 ●若山教授「大変重く受け止める」 　 検証実験の結果についてＳＴＡＰ細胞の論文の共同著者で山梨大学の若山照彦教授は「ＳＴＡＰ細胞の作製が再現できなかったとの検証結果は、論文の共著者の一人として大変重く受け止めております。今後も本問題の全容解明、解決に向けて調査などに全面的に協力していく所存です。このような事態を招きましたことを、深く反省するとともにおわび申し上げます」とするコメントを出しました。 　 ●弁護団「コメント差し控える」 　 検証実験の結果を受けて、理化学研究所の小保方晴子研究員の弁護団は、コメントを発表しました。 　 この中で、「弁護団としても、本日公表された『ＳＴＡＰ現象の検証結果』には困惑していますが、本人自身が困惑している状況ですので、弁護団からコメントをすることは差し控えさせていただきます。本人は、さまざまな意味で非常に厳しい状況の中で検証実験を続けてきましたので、今はとにかく、一度ゆっくり心身を休めてもらいたいと思っています。皆様におかれましても、本人が静かに過ごせる環境を確保できるよう、ご理解とご協力を切にお願いいたします」としています。 　 ●官房長官「立ち直って再出発を」 　 菅官房長官は午後の記者会見で、「今回の問題が、理化学研究所のみならず、日本の学会全体の評価に影響を与えた。そのことは誠に遺憾だ。信頼回復に向けてのアクションプランなどに従い、着実に改革を進め、世界に高い評価を受ける研究所として立ち直って再出発をしてほしい」と述べました。 　 一方、菅官房長官は、記者団が理化学研究所を研究者に高額な報酬を支払うことができる「特定国立研究開発法人」に指定するための法案を来年の通常国会に提出する考えがあるか質問したのに対し、「まずは着実に信頼回復に努めていくことが極めて大事だ。そのことが達成されたあとで、さまざまな動きが出てくるだろう」と述べました。

●「STAP細胞を確認できなかった」理研が記者会見で「正式発表」 小保方さんは欠席 　 STAP細胞の有無を確かめるための検証実験を進めていた理化学研究所は12月19日、東京都内で記者会見を開いた。小保方晴子研究員による検証実験と、丹羽仁史・副チームリーダーを責任者とする検証実験のいずれも、「STAP細胞の存在を確認できなかった」と発表した。 　 これらの検証実験を統括する相澤慎一チームリーダーは記者会見で「丹羽責任者によって4月から8カ月間、小保方研究員によって9月から3カ月間実験を進めてきたが、STAP現象を確認できなかった。この時点で検証実験を終了する」と述べた。会見には、小保方研究員は出席しなかった。 　 iPS細胞につづく新たな万能細胞として注目を集めたSTAP細胞の研究論文をめぐっては、理研が今年4月、「研究不正」があったと認定した。STAP細胞の存在自体にも疑義が投げかけられため、論文の著者の一人でもある丹羽氏が中心となって検証実験を進めたが、今年8月、論文通りの方法ではSTAP細胞を作れなかったとする中間報告を発表していた。 　 一方、小保方研究員は今年4月の記者会見で、論文について不備があったと認めながらも、STAP細胞の存在については、「200回以上、作製に成功しました」「STAP細胞はあります」と明言。小保方研究員自身の手によって、STAP細胞が再現できるのか注目されていた。 　 小保方研究員の検証実験は、当時所属していた理研の発生・再生科学総合研究センター内で行われ、監視カメラの設置や第三者の立ち会いのもとに進められた。

●小保方晴子研究員が「退職願」を提出「疲れ切り、大変困惑している」 　 STAP細胞の検証実験で存在が確認できなかったことを受け、理化学研究所は12月19日、小保方晴子研究員から12月21日付の退職願が提出されたことを発表した。理研は退職願を受理したという。小保方研究員の「与えられた環境の中で魂の限界まで取り組み、今はただ疲れ切り、このような結果にとどまってしまったことに大変困惑しています」とするコメントを発表した。 　 退職願を承認するに際し、野依良治理事長は「STAP論文が公表されてからこの10カ月余り、小保方晴子氏にはさまざまな心労が重なってきたことと思います、このたび退職願が提出されましたが、これ以上心の負担が増すことを懸念し、本人の意志を尊重することとしました。前途ある若者なので、前向きに新しい人生を歩まれることを期待しています」とコメントを発表した。 　 理研が発表した小保方研究員のコメント全文は以下の通り。 　 ●「責任を痛感しておりお詫びの言葉もありません」 　 どのような状況下であっても必ず十分な結果をと思い必死に過ごした3か月でした。予想をはるかに超えた制約の中での作業となり、細かな条件を検討できなかった事などが悔やまれますが、与えられた環境の中では魂の限界まで取り組み、今はただ疲れ切り、このような結果に留まってしまったことに大変困惑しております。私の未熟さゆえに論文発表・撤回に際し、理化学研究所を始め多くの皆様にご迷惑をおかけしてしまったことの責任を痛感しておりお詫びの言葉もありません。検証終了を以て退職願を提出させていただきました。最後になりますが本検証実験にあたり検証チームの皆様はじめ、ご支援・応援してくださった方々に心より御礼申し上げます。2014年12月19日 小保方 晴子

●STAP細胞再現できず　 理化学研究所は、STAP細胞の検証実験で、小保方 晴子研究員自身がSTAP細胞を再現できなかったなどとして、検証実験を打ち切ることを明らかにしました。東京都医学総合研究所の幹細胞プロジェクトリーダー・原 孝彦さんに話を聞きました。 　 (ずばり、STAP細胞は『ありません』でいい?) 　 「ありません」と言えると思います。STAP細胞というのは、それは小保方さんが開発した方法によって生み出す細胞のことをそういうふうに呼んでいますから、その方法で本人が再現できず、また第3者がこれだけの回数をやってできなかったということは、この細胞はないと言っていいと思います。 　 (もし、別の人がいわゆる万能細胞を発見したら、それはSTAP細胞ではない?) 　 それは、STAP細胞という名前ではなくて、また別のもっときちんとした名前にしたらいいと思います。 　 (小保方氏のSTAP細胞はないということ?) 　 ないです。 　 (小保方氏の『あります』というのは、うそだった?) 　 私は、本人はうそをついていたとは考えていません。ただ、最初のころ、200回成功したというところで、おそらく、緑に光る細胞がリンパ球に酸処理をすることによって出てくると、本人は、たぶん感じていたとか、経験したんだと思うんですね。しかしながら、今の条件で、同じ結果が、ほかの人が再現しないし、別の時期に本人がやってもできないということは、おそらく、最初にやった実験の過程で、何らかの見落としか、あるいはES細胞の混入といった、何かがおそらくあって、それを本人が見抜けないうちに、同じ材料を使って何回も何回も実験をしたために、同じ結果が出ていたと。 　 (下村文科相が『不正』という言葉を使ったが、不正というよりは『不手際』ということ?) 　 見落としが、まずあり、ただし、指摘されていますように、画像の改変とかあるいは、コピペして持ってくるとか、そういうことに関しては、不正ですね。したがって、両方の要素があります。 　 (近いところまでいっていたという解釈でいい?) 　 いえ、今回の結果は、近いというどころか、全くそういう現象はなかったということを意味すると思います。 　 (共同研究者、名だたる研究者の方たちが一緒にやってきた。容易に見抜いて当然のことだが、なぜそれができなかった?) 　 いろいろな特殊な事情が、たぶん重なっていたんだと思うんですけれども、こういう細胞が、遺伝子を中に入れるとか、ものすごい操作をしないと普通は出てこないもので、それをせずに、酸の溶液の中に入れるだけでできるとなると、ものすごく医療とかに、インパクトが大きいわけですよね。その期待度が、あまりにも高かったために、周りを取り囲む人間というのは、この若き女性の、新進気鋭の女性の研究者を応援したいという気持ちが上回ってしまって。いわば、これにかけてみたいという、多くのシニアの研究者たちが疑いもなくというか、その可能性にかけてみたいということで、普通だったら、ちょっといぶかしげに、例えば、わたしのような研究者がやったら、『本当なの?』って言われるプロセスが、飛ばされてしまったんでしょうね。おそらく、言葉は悪いですが、欲が出てきてしまったということなのかなと思いますね。 　 (日本の研究体制の問題もある? 短期的な成果を求められたり、独立行政法人化したり、日本の研究体制そのものが問題をはらんでいるような気がするが、そのあたりは?) 　 確かに、研究費にしても、過当競争になっておりまして、若い人のポジションが激烈な争いになっていると。そして、外国から帰ってきた人は就職しやすいけれども、しかしながら、国内でやっていた人は、ものすごいお金のもとでやっていたのに比べると、業績が足りないということで、ポストに就けない。つまり、全体として、わたしたちも含めてですが、今、ものすごく研究費を稼ぐというか、研究費を確保することが、非常に難しい時代になってきたんですね。そうしますと、どうしても、功を急ぐというか、一発当ててあげようという気持ちになってしまって、それで不正をしてはいけないわけですけどね。しかしながら、焦りが従来であれば、5年10年かけてじっくり育てていこうと思ったものを、そこまでいったんなら、1年・2年で一気にやって、ぱっと大きいところで発表しましょうよ、記者会見しましょうというふうになって、全体として、その傾向はありますね。 　 (焦りというか、前へ、前へという前のめりだった結果が?) 　 やっていることは今も昔も同じでして、わたしたちは、目の前にある現象の中から、自然界で誰も見つけたことのないことを見つけようと、日夜、頑張っているわけですね。わたしたちは、本当に、今回の一件を教訓にして、こんなことが二度と起こらないように、綱紀粛正、研究所、大学含めて、不正対策を万全に練りまして、今またもう一度立ち直って頑張ろうという機運が高まっていますので、何とかそのあたりに関して、理解していただきたいと思います。

●STAP狂奏曲のエピローグ 　 昨日(12月19日)、STAP細胞検証実験の結果についての発表が為された。論文の疑義等について3月3日、11日と7月4日に日本分子生物学会理事長としての声明を発し、8月26日付で文科省から「研究不正に関するガイドライン」が出された時点で、後は見守るしか無いと思ってきたので、1600個以上の細胞塊を移植してもキメラ胚ができなかったと知っても、特別な感覚は無い。自分の中で、STAP細胞は存在しないと納得したのは、もうずいぶんと前のことのような気がする。公表されている資料を見る限り、厳密なやり方で丁寧な実験が組まれ、きちんとその結果の記録が取られており、科学的な検証としては問題無いものと思う。監視体制の元で本人に実験を行わせたことも、今回のケースではやむを得なかっただろう。 　 発端となったNature誌2本の論文は7月4日の時点ですでに取下げられているが、では、どのような実験を元に(あるいは元にせずに)データが集められたのかについては、また追って年度内に各種細胞の遺伝子解析等についての発表があると聞く。それはそれで粛々とやって頂くしか無いが、今後のことは科学の世界で扱えない部分が多いのではないかと思う。 　 今回のSTAP狂奏曲を聴いていて一番強く感じたのは、人それぞれの受け取り方の違いが大きいということだ。研究者と非研究者では大きく異なるし、文系・理系でも違う(例えば、こちらの芦田宏直氏のFacebook記事など、私にはとても違和感がある)。理系の中でも数学や物理の専門の方々と生命科学系ではかなり感覚が違っていた。これらは、専門的に扱う対象が違い、お作法が違うからだと思うが、さらに、生命科学系でも理学系の方と医学系の方には、微妙な感覚の違いがあった。それは、真正ではないと思われるやり方で「STAP細胞を得た」と主張した人物に対する感覚においてである。 　 STAP事件は重大だが、研究不正の問題はそれだけでは無い。「ハインリッヒの法則」によれば、大きな1つの事故の背景には29の小さな事故があり、さらに300の「ヒヤリハット」が存在するという。大きな事故を防ぐには、多数存在すると思われる「ヒヤリハット」を無くさなければならない。「最後の理事長メッセージ」にも書かせて頂いたが、研究不正対応は、現場ではすでにアクション体制に入りつつある。重要な点は、平成18年度にすでに出されていた「ガイドライン」では研究不正を防ぐことができなかったという事実をもとに、今夏に決定されたものでは、研究者本人の責任のみならず、研究機関の責任が強く打ち出されている。そのため、本学でも検討の委員会が作られ、今後の体制整備についての準備が進んでいる。 　 第5期科学技術基本計画の策定も視野に入って来ているが、研究環境をどのように良くしていくかは、短期的な資金の配分だけの問題ではなく、持続的な教育や人材育成の観点も重要である。科学を行うのは、イノベーションを生み出すのは、機械ではなく人なのだ。天然資源に乏しく「科学技術立国」を提唱する我が国においては、それを支える人材を大切に育てていくことが必要である。また、そういう人材が搾取されない社会でなければならない。

● Stimulus-triggered fate conversion of somatic cells into pluripotency

● Abstract 　 Here we report a unique cellular reprogramming phenomenon, called stimulus-triggered acquisition of pluripotency (STAP), which requires neither nuclear transfer nor the introduction of transcription factors. In STAP, strong external stimuli such as a transient low-pH stressor reprogrammed mammalian somatic cells, resulting in the generation of pluripotent cells. Through real-time imaging of STAP cells derived from purified lymphocytes, as well as gene rearrangement analysis, we found that committed somatic cells give rise to STAP cells by reprogramming rather than selection. STAP cells showed a substantial decrease in DNA methylation in the regulatory regions of pluripotency marker genes. Blastocyst injection showed that STAP cells efficiently contribute to chimaeric embryos and to offspring via germline transmission. We also demonstrate the derivation of robustly expandable pluripotent cell lines from STAP cells. Thus, our findings indicate that epigenetic fate determination of mammalian cells can be markedly converted in a context-dependent manner by strong environmental cues.

● Introduction 　 In the canalization view of Waddington’s epigenetic landscape, fates of somatic cells are progressively determined as cellular differentiation proceeds, like going downhill. It is generally believed that reversal of differentiated status requires artificial physical or genetic manipulation of nuclear function such as nuclear transfer1, 2 or the introduction of multiple transcription factors3. Here we investigated the question of whether somatic cells can undergo nuclear reprogramming simply in response to external triggers without direct nuclear manipulation. This type of situation is known to occur in plants—drastic environmental changes can convert mature somatic cells (for example, dissociated carrot cells) into immature blastema cells, from which a whole plant structure, including stalks and roots, develops in the presence of auxins4. A challenging question is whether animal somatic cells have a similar potential that emerges under special conditions. Over the past decade, the presence of pluripotent cells (or closely relevant cell types) in adult tissues has been a matter of debate, for which conflicting conclusions have been reported by various groups5, 6, 7, 8, 9, 10, 11. However, no study so far has proven that such pluripotent cells can arise from differentiated somatic cells. 　 Haematopoietic cells positive for CD45 (leukocyte common antigen) are typical lineage-committed somatic cells that never express pluripotency-related markers such as Oct4 unless they are reprogrammed12, 13. We therefore addressed the question of whether splenic CD45+ cells could acquire pluripotency by drastic changes in their external environment such as those caused by simple chemical perturbations.

● Low pH triggers fate conversion in somatic cells 　 CD45+ cells were sorted by fluorescence-activated cell sorting (FACS) from the lymphocyte fraction of postnatal spleens (1-week old) of C57BL/6 mice carrying an Oct4-gfp transgene14, and were exposed to various types of strong, transient, physical and chemical stimuli (described below). We examined these cells for activation of the Oct4 promoter after culture for several days in suspension using DMEM/F12 medium supplemented with leukaemia inhibitory factor (LIF) and B27 (hereafter called LIF+B27 medium). Among the various perturbations, we were particularly interested in low-pH perturbations for two reasons. First, as shown below, low-pH treatment turned out to be most effective for the induction of Oct4. Second, classical experimental embryology has shown that a transient low-pH treatment under ‘sublethal’ conditions can alter the differentiation status of tissues. Spontaneous neural conversion from salamander animal caps by soaking the tissues in citrate-based acidic medium below pH 6.0 has been demonstrated previously15, 16, 17. 　 Without exposure to the stimuli, none of the cells sorted with CD45 expressed Oct4-GFP regardless of the culture period in LIF+B27 medium. In contrast, a 30-min treatment with low-pH medium (25-min incubation followed by 5-min centrifugation; Fig. 1a; the most effective range was pH 5.4–5.8; Extended Data Fig. 1a) caused the emergence of substantial numbers of spherical clusters that expressed Oct4-GFP in day-7 culture (Fig. 1b). Substantial numbers of GFP+ cells appeared in all cases performed with neonatal splenic cells (n = 30 experiments). The emergence of Oct4-GFP+ cells at the expense of CD45+ cells was also observed by flow cytometry (Fig. 1c, top, and Extended Data Fig. 1b, c). We next fractionated CD45+ cells into populations positive and negative for CD90 (T cells), CD19 (B cells) and CD34 (haematopoietic progenitors18), and subjected them to low-pH treatment. Cells of these fractions, including T and B cells, generated Oct4-GFP+ cells at an efficacy comparable to unfractionated CD45+ cells (25–50% of surviving cells on day 7), except for CD34+ haematopoietic progenitors19, which rarely produced Oct4-GFP+ cells (<2%; Extended Data Fig. 1d). 　 Figure 1: Stimulus-triggered conversion of lymphocytes into Oct4-GFP+ cells. 　 a, Schematic of low-pH treatment. b, Oct4-GFP+ cell clusters appeared in culture of low-pH-treated CD45+ cells (middle; high magnification, right) on day 7 (d7) but not in culture of control CD45+ cells (left). Top: bright-field view; bottom, GFP signals. Scale bar, 100 μm. c, FACS analysis. The x axis shows CD45 epifluorescence level; y axis shows Oct4-GFP level. Non-treated, cultured in the same medium but not treated with low pH. d, GFP+ (green) and GFP− (yellow) cell populations (average cell numbers per visual field; ×10 objective lens). n = 25; error bars show average ± s.d. e, Snapshots of live imaging of culture of low-pH-treated CD45+ cells (Oct4-gfp). Arrows indicate cells that started expressing Oct4-GFP. Scale bar, 50 μm. f, Cell size reduction in low-pH-treated CD45+ cells on day 1 before turning on Oct4-GFP without cell division on day 2. In this live imaging, cells were plated at a half density for easier viewing of individual cells. Scale bar, 10 μm. g, Electron microscope analysis. Scale bar, 1 μm. h, Forward scattering analysis of Oct4-GFP−CD45+ cells (red) and Oct4-GFP+CD45− cells (green) on day 7. Blue line, ES cells. i, Genomic PCR analysis of (D)J recombination at the Tcrb gene. GL is the size of the non-rearranged germline type, whereas the smaller ladders correspond to the alternative rearrangements of J exons. Negative controls, lanes 1, 2; positive controls, lane 3; FACS-sorted Oct4-GFP+ cells (two independent preparations on day 7), lanes 4, 5. 　 Among maintenance media for pluripotent cells20, the appearance of Oct4-GFP+ cells was most efficient in LIF+B27 medium, and did not occur in mouse epiblast-derived stem-cell (EpiSC) medium21, 22 (Extended Data Fig. 1e). The presence or absence of LIF during days 0–2 did not substantially affect the frequency of Oct4-GFP+ cell generation on day 7 (Extended Data Fig. 1f), whereas the addition of LIF during days 4–7 was not sufficient, indicating that LIF dependency started during days 2–4. 　 Most of the surviving cells on day 1 were still CD45+ and Oct4-GFP−. On day 3, the total cell numbers were reduced to between one-third to one-half of the day 0 population (Fig. 1d; see Extended Data Fig. 1g, h for apoptosis analysis), and a substantial number of total surviving cells became Oct4-GFP+ (Fig. 1d), albeit with relatively weak signal intensity. On day 7, a significant number of Oct4-GFP+CD45− cells (one-half to two-thirds of total surviving cells) constituted a distinct population from the Oct4-GFP−CD45− cells (Fig. 1c, top, day 7, and Fig. 1d). No obvious generation of Oct4-GFP+CD45− populations was seen in non-treated CD45+ cells cultured similarly but without low-pH treatment (Fig. 1c, bottom). 　 Low-pH-treated CD45+ cells, but not untreated cells, gradually turned on GFP signals over the first few days (Fig. 1e, Supplementary Videos 1 and 2 and Extended Data Fig. 2a), whereas CD45 immunoreactivity became gradually reduced in the cells that demonstrated Oct4-GFP expression (Fig. 1f and Extended Data Fig. 2b). By day 5, the Oct4-GFP+ cells attached together and formed clusters by accretion. These GFP+ clusters (but not GFP− cells) were quite mobile and often showed cell processes on moving (Supplementary Video 1). 　 The Oct4-GFP+ cells demonstrated a characteristic small cell size with little cytoplasm and also showed a distinct fine structure of the nucleus compared with that of parental CD45+ lymphocytes (Fig. 1g). The Oct4-GFP+ cells on day 7 were smaller than non-treated CD45+ cells (Fig. 1g, h and Extended Data Fig. 2c) and embryonic stem (ES) cells (Fig. 1h), both of which are generally considered to be small in size. The diameter of low-pH-treated CD45+ cells became reduced during the first 2 days, even before they started Oct4-GFP expression (Fig. 1f), whereas the onset of GFP expression was not accompanied by cell divisions. Consistent with this, no substantial 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) uptake was observed in the Oct4-GFP+ cells after the stressor (Extended Data Fig. 2d). 　 The lack of substantial proliferation argues against the possibility that CD45− cells, contaminating as a very minor population in the FACS-sorted CD45+ cells, quickly grew and formed a substantial Oct4-GFP+ population over the first few days after the low-pH treatment. In addition, genomic rearrangements of Tcrb (T-cell receptor gene) were observed in Oct4-GFP+ cells derived from FACS-purified CD45+ cells and CD90+CD45+ T cells (Fig. 1i, lanes 4, 5, and Extended Data Fig. 2e–g), indicating at least some contribution from lineage-committed T cells. Thus, Oct4-GFP+ cells were generated de novo from low-pH-treated CD45+ haematopoietic cells by reprogramming, rather than by simple selection of stress-enduring cells23.

● Low-pH-induced Oct4+ cells have pluripotency 　 On day 7, the Oct4-GFP+ spheres expressed pluripotency-related marker proteins22 (Oct4, SSEA1, Nanog and E-cadherin; Fig. 2a) and marker genes (Oct4, Nanog, Sox2, Ecat1 (also called Khdc3), Esg1 (Dppa5a), Dax1 (Nrob1) and Rex1 (Zfp42); Fig. 2b and Extended Data Fig. 3a) in a manner comparable to those seen in ES cells24. Moderate levels of expression of these pluripotency marker genes were observed on day 3 (Fig. 2b and Extended Data Fig. 3b). Notably, the Oct4-GFP+ cells on day 3, but not on day 7, expressed early haematopoietic marker genes such as Flk1 (also called Kdr) and Tal1 (Extended Data Fig. 3c), indicating that Oct4-GFP+ cells on day 3, as judged by their expression pattern at the population level, were still in a dynamic process of conversion. 　 Figure 2: Low-pH-induced Oct4-GFP+ cells represent pluripotent cells. 　 a, Immunostaining for pluripotent cell markers (red) in day 7 Oct4-GFP+ (green) clusters. DAPI, white. Scale bar, 50 μm. b, qPCR analysis of pluripotency marker genes. From left to right, mouse ES cells; parental CD45+ cells; low-pH-induced Oct4-GFP+ cells on day 3; low-pH-induced Oct4-GFP+ cells on day 7. n = 3; error bars show average ± s.d. c, DNA methylation study by bisulphite sequencing. Filled and open circles indicate methylated and non-methlylated CpG, respectively. d, Immunostaining analysis of in vitro differentiation capacity of day 7 Oct4-GFP+ cells. Ectoderm: the neural markers Sox1/Tuj1 (100%, n = 8) and N-cadherin (100%, n = 5). Mesoderm: smooth muscle actin (50%, n = 6) and brachyury (40%, n = 5). Endoderm: Sox17/E-cadherin (67%, n = 6) and Foxa2/Pdgfrα (67%, n = 6). Scale bar, 50 μm. e, Teratoma formation assay of day 7 clusters of Oct4-GFP+ cells. Haematoxylin and eosin staining showed keratinized epidermis (ectoderm), skeletal muscle (mesoderm) and intestinal villi (endoderm), whereas immunostaining showed expression of Tuj1 (neurons), smooth muscle actin and α-fetoprotein. Scale bar, 100 μm. f–i, Dissociation culture of ES cells and STAP cells (additional 7 days from day 7; f, g) on gelatin-coated dishes. Top, bright-field; bottom, alkaline phosphatase (AP) staining. Partially dissociated STAP cells slowly generated small colonies (i), whereas dissociated STAP cells did not, even in the presence of the ROCK inhibitor (g, h), which allows dissociation culture of EpiSCs29. 　 On day 7, unlike CD45+ cells and like ES cells, low-pH-induced Oct4-GFP+ cells displayed extensive demethylation at the Oct4 and Nanog promoter areas (Fig. 2c), indicating that these cells underwent a substantial reprogramming of epigenetic status in these key genes for pluripotency. 　 In vitro differentiation assays25, 26, 27 demonstrated that low-pH-induced Oct4-GFP+ cells gave rise to three-germ-layer derivatives (Fig. 2d) as well as visceral endoderm-like epithelium (Extended Data Fig. 3d). When grafted into mice, low-pH-induced Oct4-GFP+ cell clusters formed teratomas (40%, n = 20) (Fig. 2e and Extended Data Fig. 4a–c) but no teratocarcinomas that persistently contained Oct4-GFP+ cells (n = 50). Because some cellular variation was observed in the signal levels of Oct4-GFP within the clusters, we sorted GFP-strong cells (a major population) and GFP-dim cells (a minor population) by FACS on day 7 and separately injected them into mice. In this case, only GFP-strong cells formed teratomas (Extended Data Fig. 4d). In quantitative polymerase chain reaction (qPCR) analysis, the GFP-strong population expressed pluripotency marker genes but not early lineage-specific marker genes, whereas the GFP-dim cells showed substantial expression of some early lineage-specific marker genes (Flk1, Gata2, Gata4, Pax6 and Sox17; Extended Data Fig. 4e) but not Nanog and Rex1. These observations indicate that three-germ-layer derivatives were generated from the GFP-strong cells expressing pluripotency marker genes, rather than from GFP-dim cells that seem to contain partially reprogrammed cells. 　 Collectively, these findings show that the differentiation state of a committed somatic cell lineage can be converted into a state of pluripotency by strong stimuli given externally. Hereafter, we refer to the fate conversion from somatic cells into pluripotent cells by strong external stimuli such as low pH as ‘stimulus-triggered acquisition of pluripotency’ (STAP) and the resultant cells as STAP cells. Under their establishment conditions, these STAP cells were rarely proliferative (Extended Data Figs 2d and 5a, b). Comparative genomic hybridization array analysis of STAP cells indicated no major global changes in chromosome number (Extended Data Fig. 5c).

● STAP cells compared to ES cells 　 STAP cells, unlike mouse ES cells, showed a limited capacity for self-renewal in the LIF-containing medium and did not efficiently form colonies in dissociation culture (Fig. 2f, g), even in the presence of the ROCK inhibitor Y-27632, which suppresses dissociation-induced apoptosis28, 29 (Fig. 2h). Also, even under high-density culture conditions after partial dissociation (Fig. 2i), STAP cell numbers started to decline substantially after two passages. Furthermore, expression of the ES cell marker protein Esrrβ was low in STAP cells (Extended Data Fig. 5d, e). In general, female ES cells do not show X-chromosomal inactivation30 and contain no H3K27me3-dense foci (indicative of inactivated X chromosomes), unlike female CD45+ cells and EpiSCs. In contrast, H3K27me3-dense foci were found in ~40% of female STAP cells strongly positive for Oct4-GFP (Extended Data Fig. 5f, g). 　 STAP cells were also dissimilar to mouse EpiSCs, another category of pluripotent stem cell21, 22, 29, 31, and were positive for Klf4 and negative for the epithelial tight junction markers claudin 7 and ZO-1 (Extended Data Fig. 5d, e).

● STAP cells from other tissue sources 　 We next performed similar conversion experiments with somatic cells collected from brain, skin, muscle, fat, bone marrow, lung and liver tissues of 1-week-old Oct4-gfp mice. Although conversion efficacy varied, the low-pH-triggered generation of Oct4-GFP+ cells was observed in day 7 culture of all tissues examined (Fig. 3a and Extended Data Fig. 6a–c), including mesenchymal cells of adipose tissues (Fig. 3a–c) and neonatal cardiac cells that were negatively sorted for CD45 by FACS (Fig. 3d–g; see Extended Data Fig. 6d for suppression of cardiac genes such as Nkx2-5 and cardiac actin). 　 Figure 3: STAP cell conversion from a variety of cells by low-pH treatment. 　 a, Percentage of Oct4-GFP+ cells in day 7 culture of low-pH-treated cells from different origins (1 × 105 cells per ml × 3 ml). The number of surviving cells on day 7 compared to the plating cell number was 20–30%, except for lung, muscle and adipose cells, for which surviving cells were ~10% (n = 3, average ± s.d.). b, Oct4-GFP+ cell clusters were induced by low-pH treatment from adipose-tissue-derived mesenchymal cells on day 7. Scale bar, 100 μm. c, Expression of pluripotent cell markers in day 7 clusters of low-pH-treated adipose-tissue-derived mesenchymal cells. Scale bar, 50 μm. d, Expression of pluripotency marker genes in STAP cells derived from various tissues. Gene expressions were normalized by Gapdh (n = 3, average ± s.d.). Asterisk indicates adipose tissue-derived mesenchymal cells. e, Quantification of Oct4-GFP+ cells in culture of low-pH-treated neonatal cardiac muscle cells. ***P < 0.001; Tukey’s test (n = 3). f, Generation of Oct4-GFP+ cell clusters (d7) from CD45− cardiac muscle cells. g, qPCR analysis of pluripotency marker genes in STAP cells from CD45− cardiac muscle cells.

● Chimaera formation and germline transmission in mice 　 We next performed a blastocyst injection assay with STAP cells that were generated from CD45+ cells of neonatal mice constitutively expressing GFP (this C57BL/6 line with cag-gfp transgenes is referred to hereafter as B6GFP). We injected STAP cell clusters en bloc that were manually cut into small pieces using a microknife (Fig. 4a). A high-to-moderate contribution of GFP-expressing cells was seen in the chimaeric embryos (Fig. 4b and Extended Data Fig. 7a). These chimaeric mice were born at a substantial rate and all developed normally (Fig. 4c and Extended Data Fig. 7b). 　 Figure 4: Chimaeric mouse generation from STAP cells. 　 a, Schematic of chimaeric mouse generation. b, E13.5 chimaera fetuses from 2N blastocytes injected with STAP cells (derived from B6GFP CD45+ cells carrying cag-gfp). c, Adult chimaeric mice generated by STAP-cell (B6GFP × 129/Sv; agouti) injection into blastocysts (ICR strain; albino). Asterisk indicates a highly contributed chimaeric mouse. d, Chimaera contribution analysis. Tissues from nine pups were analysed by FACS. e, Offspring of chimaeric mice derived from STAP cells. Asterisk indicates the same chimaeric mouse shown in c. f, E10.5 embryo generated in the tetraploid complementation assay with STAP cells (B6GFP × 129/Sv). 　 CD45+ cell-derived STAP cells contributed to all tissues examined (Fig. 4d). Furthermore, offspring derived from STAP cells were born to the chimaeric mice (Fig. 4e and Extended Data Fig. 7c), demonstrating their germline transmission, which is a strict criterion for pluripotency as well as genetic and epigenetic normality32, 33. Furthermore, in a tetraploid (4N) complementation assay, which is considered to be the most rigorous test for developmental potency34, 35 (Fig. 4a, bottom), CD45+ cell-derived STAP cells (from F1 mice of B6GFP × 129/Sv or DBA/2) generated all-GFP+ embryos on embryonic day (E)10.5 (Fig. 4f, Extended Data Fig. 7d and Supplementary Video 3), demonstrating that STAP cells alone are sufficient to construct an entire embryonic structure. Thus, STAP cells have the developmental capacity to differentiate into all somatic-cell lineages as well as germ-cell lineages in vivo.

● Expandable pluripotent cell lines from STAP cells 　 STAP cells have a limited self-renewal capacity under the conditions used for establishment (Fig. 2g and Extended Data Figs 2e and 5a). However, in the context of the embryonic environment, a small fragment of a STAP cell cluster could grow even into a whole embryo (Fig. 4f). With this in mind, we next examined whether STAP cells have the potential to generate expandable pluripotent cell lines in vitro under certain conditions. 　 STAP cells could not be efficiently maintained for additional passages in conventional LIF+FBS-containing medium or 2i medium20 (most STAP cells died in 2i medium within 7 days; Extended Data Fig. 8a). Notably, an adrenocorticotropic hormone (ACTH)+LIF-containing medium (hereafter called ACTH medium) known to facilitate clonal expansion of ES cells36 supported outgrowth of STAP cell colonies. When cultured in this medium on a MEF feeder or gelatin, a portion of STAP cell clusters started to grow (Fig. 5a, bottom; such outgrowth was typically found in 10–20% of wells in single cluster culture using 96-well plates and in >75% when 12 clusters were plated per well). These growing colonies looked similar to those of mouse ES cells and expressed a high level of Oct4-GFP. 　 Figure 5: ES-cell-like stem cells can be derived from STAP cells. 　 a, Growth of STAP stem cells carrying Oct4-gfp. Scale bar, 50 μm. b, Dissociation culture of STAP stem cells to form colonies. Scale bar, 100 μm. c, Robust growth of STAP stem cells in maintenance culture. Similar results were obtained with eight independent lines. In contrast, parental STAP cells decreased in number quickly. d, Immunostaining of STAP stem cells for pluripotency markers (red). Scale bar, 50 μm. e, qPCR analysis of pluripotency marker gene expression. f–h, In vitro differentiation assays into three-germ-layer derivatives. f, Ectoderm: Rx+/Pax6+ (retinal epithelium; 83%, n = 6). g, Mesoderm: troponin-T+ (cardiac muscle; 50%, n = 6). h, Endoderm: Sox17+/E-cadherin+ (endodermal progenitors; 67%, n = 6). Scale bar, 50 μm. i, Teratoma formation assays. Formation of keratinized epidermis (ectoderm; left), cartilage (mesoderm; middle) and bronchial-like epithelium (endoderm; right) is shown. Scale bar, 100 μm. j, Blastocyst injection assays. These pictures of live animals were taken serially (asterisk indicates the same chimaeric pup). k, l, Tetraploid complementation assay. ‘All-GFP+’ pups were born (k) and germline transmission was observed (l). 　 After culturing in ACTH medium for 7 days, this growing population of cells, unlike parental STAP cells, could be passaged as single cells (Fig. 5a, bottom, and Fig. 5b), grow in 2i medium (Extended Data Fig. 8a) and expand exponentially, up to at least 120 days of culture (Fig. 5c; no substantial chromosomal abnormality was seen; Extended Data Fig. 8b, c). Hereafter, we refer to the proliferative cells derived from STAP cells as STAP stem cells. 　 STAP stem cells expressed protein and RNA markers for pluripotent cells (Fig. 5d, e), showed low DNA methylation levels at the Oct4 and Nanog loci (Extended Data Fig. 8d), and had a nuclear fine structure similar to that of ES cells (Extended Data Fig. 8e; few electron-dense areas corresponding to heterochromatin). In differentiation culture25, 26, 27, STAP stem cells generated ectodermal, mesodermal and endodermal derivatives in vitro (Fig. 5f–h and Extended Data Fig. 8f, g), including beating cardiac muscles (Supplementary Video 4), and formed teratomas in vivo (Fig.5i and Extended Data Fig. 8h; no teratocarcinomas, n = 40). After blastocyst injection, STAP stem cells efficiently contributed to chimaeric mice (Fig. 5j), in which germline transmission was seen (Extended Data Fig. 8i). Even in tetraploid complementation assays, injected STAP stem cells could generate mice capable of growing to adults and producing offspring (Fig. 5k, l; in all eight independent lines, Extended Data Fig. 8j). 　 In addition to their expandability, we noticed at least two other differences between STAP stem cells and parental S TAP cells. First, the expression of the ES cell marker protein Es rrβhich was undetectable in STAP cells (Extended 4Data Fig. 5d, e), was clearly seen in STAP stem cells (Fig. 5e). Second, the presence of H3K27me3 foci, which was found in a substantial proportion of female STAP cells, was no longer observed in STAP stem cells (Extended Data Figs 5f and 8k). Thus, STAP cells have the potential to give rise to expandable cell lines that exhibit features similar to those of ES cells.

● Discussion 　 This study has revealed that somatic cells latently possess a surprising plasticity. This dynamic plasticity—the ability to become pluripotent cells—emerges when cells are transiently exposed to strong stimuli that they would not normally experience in their living environments. 　 Low-pH treatment was also used in the ‘autoneuralization’ experiment15, 16, 17 by Holtfreter in 1947, in which exposure to acidic medium caused tissue-autonomous neural conversion of salamander animal caps in vitro in the absence of Spemann’s organizer signals. Although the mechanism has remained elusive, Holtfreter hypothesized that the strong stimulus releases the animal cap cells from some intrinsic inhibitory mechanisms that suppress fate conversion or, in his words, they pass through ‘sublethal cytolysis’ (meaning stimulus-evoked lysis of the cell’s inhibitory state)15, 37. Although Holtfreter’s study and ours differ in the direction of fate conversion—orthograde differentiation and nuclear reprogramming, respectively—these phenomena may share some common aspects, particularly with regard to sublethal stimulus-evoked release from a static (conversion-resisting) state in the cell. 　 A remaining question is whether cellular reprogramming is initiated specifically by the low-pH treatment or also by some other types of sublethal stress such as physical damage, plasma membrane perforation, osmotic pressure shock, growth-factor deprivation, heat shock or high Ca2+ exposure. At least some of these stressors, particularly physical damage by rigorous trituration and membrane perforation by streptolysin O, induced the generation of Oct4-GFP+ cells from CD45+ cells (Extended Data Fig. 9a; see Methods). These findings raise the possibility that certain common regulatory modules, lying downstream of these distantly related sublethal stresses, act as a key for releasing somatic cells from the tightly locked epigenetic state of differentiation, leading to a global change in epigenetic regulation. In other words, unknown cellular functions, activated by sublethal stimuli, may set somatic cells free from their current commitment to recover the naive cell state. 　 Our present finding of an unexpectedly large capacity for radical reprogramming in committed somatic cells raises various important questions. For instance, why, and for what purpose, do somatic cells latently possess this self-driven ability for nuclear reprogramming, which emerges only after sublethal stimulation, and how, then, is this reprogramming mechanism normally suppressed? Furthermore, why isn’t teratoma (or pluripotent cell mass) formation normally seen in in vivo tissues that may receive strong environmental stress? In our preliminary study, experimental reflux oesophagitis locally induced moderate expression of Oct4-GFP but not endogenous Nanog in the mouse oesophageal mucosa (Extended Data Fig. 9b). Therefore, an intriguing hypothesis for future research is that the progression from initial Oct4 activation to further reprogramming is suppressed by certain inhibitory mechanisms in vivo. 　 The question of why and how this self-driven reprogramming is directed towards the pluripotent state is fundamentally important, given that STAP reprogramming takes a remarkably short period, only a few days for substantial expression of pluripotency marker genes, unlike transgene- or chemical-induced iPS cell conversion38. Thus, our results cast new light on the biological meaning of diverse cellular states in multicellular organisms.

● Methods 　 ● Animal studies 　 Research involving animals complied with protocols approved by the Harvard Medical School/Brigham and Women’s Hospital Committee on Animal Care, and the Institutional Committee of Laboratory Animal Experimentation of the RIKEN Center for Developmental Biology. 　 ● Tissue collection and low-pH treatment 　 To isolate CD45+ haematopoietic cells, spleens were excised from 1-week-old Oct4-gfp mice (unless specified otherwise), minced by scissors and mechanically dissociated with pasture pipettes. Dissociated spleen cells were suspended with PBS and strained through a cell strainer (BD Biosciences). After centrifuge at 1,000 r.p.m. for 5 min, collected cells were re-suspended in DMEM medium and added to the same volume of lympholyte (Cedarlane), then centrifuged at 1,000g for 20 min. The lymphocyte layer was taken out and stained with CD45 antibody (ab25603, Abcam). CD45-positive cells were sorted by FACS Aria (BD Biosciences). After cell sorting, 1 × 106 CD45-positive cells were treated with 500 μl of low-pH HBSS solution (titrated to pH5.7 by HCl) for 25 min at 37 °C, and then centrifuged at 1,000 r.p.m. at room temperature for 5 min. After the supernatant (low-pH solution) was removed, precipitated cells were re-suspended and plated onto non-adhesive culture plates (typically, 1 × 105 cells ml−1) in DMEM/F12 medium supplemented with 1,000 U LIF (Sigma) and 2% B27 (Invitrogen). Cell cluster formation was more sensitive to the plating cell density than the percentage of Oct4-GFP+ cells. The number of surviving cells was sensitive to the age of donor mice and was low under the treatment conditions above when adult spleens were used. The addition of LIF during days 2–7 was essential for generating Oct4-GFP+ STAP cell clusters on day 7, as shown in Extended Data Fig. 1f. Even in the absence of LIF, Oct4-GFP+ cells (most of them were dim in signal) appeared transiently during days 2–5 in culture of low-pH-treated CD45+ cells, but subsequently disappeared, indicating that there is a LIF-independent early phase, whereas the subsequent phase is LIF-dependent. ● Chimaeric mouse generation and analyses 　 For production of diploid and tetraploid chimaeras with STAP cells, diploid embryos were obtained from ICR strain females. Tetraploid embryos were produced by electrofusion of 2-cell embryos. Because trypsin treatment of donor samples turned out to cause low chimaerism, STAP spherical colonies were cut into small pieces using a microknife under the microscope, and small clusters of STAP cells were then injected into day-4.5 blastocysts by a large pipette. The next day, the chimaeric blastocysts were transferred into day-2.5 pseudopregnant females. For experiments using STAP cells from CD45+ cells without the Oct4-gfp reporter, STAP cell clusters were identified by their characteristic cluster morphology (they are made of very small cells with no strong compaction in the aggregate). When the STAP conversion conditions (low pH) were applied to CD45+ lymphocytes, most day-7 clusters that were large and contained more than a few dozen small cells were positive for Oct4 (although the expression level varied). Therefore, we used only well-formed characteristic clusters (large ones) for this type of study and cut them by microknife to prepare donor cell clusters in a proper size for glass needle injection. For an estimate of the contribution of these injected cells, we used STAP cells that were generated from CD45+ cells of mice constitutively expressing GFP (C57BL/6 line with cag-gfp transgenes; F1 of C57BL/6 and 129/Sv or DBA/2 was used from the viewpoint of heterosis). 　 Because the number of CD45+ cells from a neonatal spleen was small, we mixed spleen cells from male and female mice for STAP cell conversion. To make germline transmission more efficient, we intercrossed chimaeras in some experiments. 　 For the production of diploid and tetraploid chimaeras with STAP stem cells, diploid embryos were obtained from ICR strain females. Tetraploid embryos were produced by electrofusion of 2-cell embryos. STAP stem cells were dissociated into single cells and injected into day-4.5 blastocysts. In the chimaera studies with both STAP cells and STAP stem cells, we did not find tumorigenetic tendencies in their chimaeras or their offspring (up to 18 months). ● In vivo differentiation assay 　 1 × 107 STAP cells were seeded onto a sheet composed of a non-woven mesh of polyglycolic acid fibres (3 × 3 × 1 mm; 200 μm in pore diameter), cultured for 24 h in DMEM + 10% FBS, and implanted subcutaneously into the dorsal flanks of 4-week-old mice. In this experiment, to better support tumour formation from slow growing STAP cells by keeping cells in a locally dense manner, we implanted STAP cells with artificial scaffold made of polyglycolic acid fibres. Given the artificial nature of the material, we used NOD/SCID mice as hosts, to avoid possible enhancement of post-graft inflammation caused by this scaffold even in syngenic mice. STAP stem cells were dissociated into single cells and cell suspension containing 1 × 107 cells was injected into the testis. Six weeks later, the implants were analysed using histochemical techniques. The implants were fixed with 10% formaldehyde, embedded in paraffin, and routinely processed into 4-µm-thick sections. Sections were stained with haematoxylin and eosin. Endoderm tissues were identified with expression of anti-α-fetoprotein (mouse monoclonal antibody; MAB1368, R&D Systems). Ectodermal tissues were identified with expression of anti-βIII tubulin (mouse monoclonal antibody; G7121, Promega). Mesodermal tissues were identified with expression of anti-α-smooth muscle actin (rabbit polyclonal; DAKO). In negative controls, the primary antibody was replaced with IgG-negative controls of the same isotype to ensure specificity. 　 ● STAP by exposure to other external stimuli 　 To give a mechanical stress to mature cells, a pasture pipette was heated and then stretched to create thin capillaries with the lumens approximately 50 μm in diameter, and then broken into appropriate lengths. Mature somatic cells were then repeatedly triturated through these pipettes for 20 min, and then cultured for 7 days. To provide a heat shock, cells were heated at 42 °C for 20 min and cultured for 7 days. A nutrition-deprivation stress was provided to mature cells, by culturing the cells in basal culture medium for 3 weeks. High Ca2+ concentration stress was provided to mature cells by culturing cells in medium containing 2 mM CaCl2 for 7 days. To give a strong stress by creating pores in cell membranes, cells were treated with 230 ng ml−1 streptolysine O (SLO) (S5265, Sigma) for 2 h, then cultured for 7 days. After each treatment, the ratio of Oct4-GFP-positive cells was analysed by FACS. ● Bisulphite sequencing 　 GFP-positive cells in STAP clusters were collected by FACS Aria. Genomic DNA was extracted from STAP cells and analysed. Bisulphite treatment of DNA was performed using the CpGenome DNA modification kit (Chemicon, http://www.chemicon.com), following the manufacturer’s instructions. The resulting modified DNA was amplified by nested PCR using two forward (F) primers and one reverse (R) primer: Oct4 (F1, 5′-GTTGTTTTGTTTTGGTTTTGGATAT-3′; F2, 5′-ATGGGTTGAAATATTGGGTTTATTTA-3′; R, 5′-CCACCCTCTAACCTTAACCTCTAAC-3′). And Nanog (F1, 5′-GAGGATGTTTTTTAAGTTTTTTTT-3′; F2, 5′-AATGTTTATGGTGGATTTTGTAGGT-3′; R, 5′-CCCACACTCATATCAATATAATAAC-3′). PCR was done using TaKaKa Ex Taq Hot Start Version (RR030A). DNA sequencing was performed using a M13 primer at the Genome Resource and Analysis Unit, RIKEN CDB. 　 ● Immunohistochemistry 　 Cultured cells were fixed with 4% paraformaldehyde and permeabilized with 0.1% Triton X-100/PBS before blocking with 1% BSA solution. Cells were incubated with the following primary antibodies: anti-Oct4 (Santa Cruz Biotechnology; C-10), anti-Nanog (eBioscience; MLC-51), anti-SSEA-1 (Millipore; MC480), anti-E-cadherin (Abcam), anti-ZO-1 (Santa Cruz Biotechnology; c1607), anti-claudin7 (Abcam), anti-Klf4 (R&D Systems), anti-Esrrβ (R&D Systems), anti-H3K27me3 (Millipore), anti-BrdU (BD Bioscience) and anti-Ki67 (BD Pharmingen). After overnight incubation, cells were incubated with secondary antibodies: goat anti-mouse or -rabbit coupled to Alexa-488 or -594 (Invitrogen). Cell nuclei were visualized with DAPI (Sigma). Slides were mounted with a SlowFade Gold antifade reagent (Invitrogen). ● Fluorescence-activated cell sorting and flow cytometry 　 Cells were prepared according to standard protocols and suspended in 0.1% BSA/PBS on ice before FACS. Propidium iodide (BD Biosciences) was used to exclude dead cells. In negative controls, the primary antibody was replaced with IgG-negative controls of the same isotype to ensure specificity. Cells were sorted on a BD FACSAria SORP and analysed on a BD LSRII with BD FACS Diva Software (BD Biosciences). For haematopoietic fraction sorting, antibodies against T-cell marker (anti-CD90; eBioscience), B-cell marker (anti-CD19; Abcam) and haematopoietic progenitor marker (anti-CD34; Abcam) were used. ● RNA preparation and RT–PCR analysis 　 RNA was isolated with the RNeasy Micro kit (Qiagen). Reverse transcription was performed with the SuperScript III first strand synthesis kit (Invitrogen). Power SYBR Green Mix (Roche Diagnostics) was used for amplification, and samples were run on a Lightcycler-II Instrument (Roche Diagnostics). The primer sets for each gene are listed in Supplementary Table 1. 　 ● In vitro differentiation assays 　 For mesodermal differentiation assay, STAP cells were collected at 7 days, and Oct4-GFP-positive cells were collected by cell sorter and subjected to culture in DMEM supplemented with 20% FBS. Medium was exchanged every 3 days. After 7–14 days, muscle cells were stained with an anti-α-smooth muscle actin antibody (DAKO). 　 For neural lineage differentiation assay, STAP cells were collected at 7 days and subjected to SDIA or SFEBq culture. For SDIA culture, collected STAP cell clusters were plated on PA6 cell feeder as described previously26. For SFEBq culture, STAP cell clusters (one per well; non-cell-adhesive 96-well plate, PrimeSurface V-bottom, Sumitomo Bakelite) were plated and cultured in suspension as described previously36. 　 For endodermal differentiation, STAP cells were collected at 7 days and subjected to suspension culture with inducers in 96-well plates27. 　 ● TCR-β chain gene rearrangement analysis 　 Genomic DNA was extracted from STAP cells and tail tips from chimaeric mice generated with STAP cells derived from CD45+ cells. PCR was performed with 50 ng DNA using the following primers (Dβ2: 5′-GCACCTGTGGGGAAGAAACT-3′ and Jβ2.6: 5′-TGAGAGCTGTCTCCTACTATCGATT-3′) that amplify the regions of the (D)J recombination. The PCR products were subjected to gel electrophoresis in Tris-acetate-EDTA buffer with 1.6% agarose and visualized by staining with ethidium bromide. PCR bands from STAP cells were subjected to sequencing analysis and identified as rearranged genomic fragments of the (D)J recombination. 　 ● EdU uptake assay and apoptosis analysis 　 At various phases in STAP cell culture (days 0–2, 2–7, 7–14), EdU was added to the culture medium (final concentration: 10 μM) and EdU uptake was analysed by FACS. This assay was performed according to the manufacturer’s protocol with the Click-iT EdU Flow cytometry assay kit (Invitrogen). 　 Apoptosis analysis was performed with flow cytometry using Annexin-V (Biovision) and propidium iodide. Annexin-V analysis by FACS on day 14 showed that most Oct4-GFP+ cells were positive for this apoptotic marker; indeed, the number of surviving cells declined thereafter. 　 ● Soft agar assay 　 Sorted STAP cells (Oct4-GFP-strong or -dim) and control mouse ES cells (1,000 cells per well of 96-well plate) were plated into soft ager medium (0.4% agarose) in LIF-B27 medium. After 7 days of culture, cells were dissociated and their anchorage-independent growth was quantified by fluorescent measurement with the cytoselect 96-well cell transformation assay kit (Cell Biolabs) according to the manufacturer’s protocol. 　 ● Comparative genomic hybridization (CGH) array analysis 　 Genomic DNA was extracted from STAP (male) and CD45-positive cells (male) by the Gene JET Genomic DNA purification kit (Thermo Scientific). Using CGH array (Agilent), the normality of chromosomes derived from STAP was compared with that of CD45-positive cells whose chromosomal normality was confirmed by a separate experiment. CGH array and data analysis were performed at TAKARA Bio. 　 ● Electron microscopy 　 For electron microscopic analysis, dissociated cells were fixed in 2.5% glutaraldehyde and 2% formaldehyde in 0.1 M cacodylate buffer (pH 7.2) and then processed for thin sectioning and transmission electron microscopy. 　 ● Live cell imaging 　 All live-cell imaging was performed with LCV110-CSUW1 (Olympus). For live-cell imaging of ‘in culture CD45 antibody staining’, CD45+ cells treated with low pH were plated in culture medium containing 20 ng ml−1 of fluorescent-labelled CD45 antibody (eBioscience)40. 　 ● RNA-sequencing and ChIP sequencing analyses 　 For RNA sequencing of cell lines, total RNA was extracted from cells by the RNasy mini kit (Qiagen). RNA-seq libraries were prepared from 1 μg total RNAs following the protocol of the TruSeq RNA Sample Prep kit (Illumina) and subjected to the deep sequencing analysis with Illumina Hi-Seq1500. Cluster tree diagram of various cell types was obtained from hierarchical clustering of global expression profiles (log2 FPKM of all transcripts; FPKM, fragments per kilobase of transcript per million mapped reads). Complete linkage method applied to 1 − r (r = Pearson’s correlation between profiles) was used for generating the tree and 1,000 cycles of bootstrap resampling were carried out to obtain statistical confidence score in per cent units (also called AU P values). 　 ChIP-seq libraries were prepared from 20 ng input DNAs, 1 ng H3K4me3 ChIP DNAs, or 5 ng H3K27me3 ChIP DNAs using the KAPA Library Preparation kit (KAPA Biosystems). TruSeq adaptors were prepared in-house by annealing a TruSeq universal oligonucleotide and each of index oligonucleotides. 　 Chromatin immunoprecipitation was performed as follows. Cells were fixed in PBS(-) containing 1% formaldehyde for 10 min at room temperature. Glycine was added to a final concentration of 0.25 M to stop the fixation. After washing the cells twice in ice-cold PBS(-), cells were further washed in LB1 (50 mM HEPES-KOH pH 7.5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 0.5% NP-40, 0.25% Triton X-100) and LB2 (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA). Cells were then re-suspended in lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA, 1% SDS). Lysates were prepared by sonication using Covaris S220 in a mini tube at duty cycle = 5%, PIP = 70, cycles per burst = 200, and the treatment time of 20 min. Lysates from 2 × 106 cells were diluted in ChIP dilution buffer (16.7 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl, 1.2 mM EDTA, 1.1% Triton X-100, 0.01% SDS). ChIP was performed using sheep anti-mouse IgG beads (Invitrogen) or protein A beads (Invitrogen) coupled with anti-histone H3K4me3 antibody (Wako, catalogue no. 307-34813) or anti-histone H3K27me3 antibody (CST, catalogue no. 9733), respectively. After 4–6 h of incubation in a rotator at 4 °C, beads were washed five times in low-salt wash buffer (20 mM Tris HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0.1% SDS), and three times in high-salt wash buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0.1% SDS). Target chromatin was eluted off the beads in elution buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% SDS) at room temperature for 20 min. Crosslink was reversed at 65 °C, and then samples were treated with RNaseA and proteinase K. The prepared DNA samples were purified by phenol-chloroform extraction followed by ethanol precipitation and dissolved in TE buffer. 　 ● STAP stem-cell conversion culture 　 For establishment of STAP stem-cell lines, STAP cell clusters were transferred to ACTH-containing medium36 on MEF feeder cells (several clusters, up to a dozen clusters, per well of 96-well plates). Four to seven days later, the cells were subjected to the first passage using a conventional trypsin method, and suspended cells were plated in ES maintain medium containing 20% FBS. Subsequent passaging was performed at a split ratio of 1:10 every second day before they reached subconfluency. We tested the following three different genetic backgrounds of mice for STAP stem-cell establishment from STAP cell clusters, and observed reproducible data of establishment: C57BL/6 carrying Oct4-gfp (29 of 29), 129/Sv carrying Rosa26-gfp (2 of 2) and 129/Sv × C57BL/6 carrying cag-gfp (12 of 16). STAP stem cells with all these genetic backgrounds showed chimaera-forming activity. 　 For clonal analysis of STAP stem cells, single STAP stem cells were manually picked by a thin-glass pipette, and plated into 96-well plates at one cell per well. The clonal colonies were cultured in ES medium containing 20% FBS, and expanded for subsequent experiments. 　 ● Karyotype analysis 　 Karyotype analysis was performed by Multicolor FISH analysis (M-FISH). Subconfluent STAP stem cells were arrested in metaphase by colcemid (final concentration 0.270 µg ml−1) to the culture medium for 2.5 h at 37 °C in 5% CO2. Cells were washed with PBS, treated with trypsin and EDTA (EDTA), re-suspended into cell medium and centrifuged for 5 min at 1,200 r.p.m. To the cell pellet in 3 ml of PBS, 7 ml of a pre-warmed hypotonic 0.0375 M KC1 solution was added. Cells were incubated for 20 min at 37 °C. Cells were centrifuged for 5 min at 1,200 r.p.m. and the pellet was re-suspended in 3–5 ml of 0.0375 M KC1 solution. The cells were fixed with methanol/acetic acid (3:1; vol/vol) by gently pipetting. Fixation was performed four times before spreading the cells on glass slides. For the FISH procedure, mouse chromosome-specific painting probes were combinatorially labelled using seven different fluorochromes and hybridized as previously described41. For each cell line, 9–15 metaphase spreads were acquired by using a Leica DM RXA RF8 epifluorescence microscope (Leica Mikrosysteme GmbH) equipped with a Sensys CCD camera (Photometrics). Camera and microscope were controlled by the Leica Q-FISH software (Leica Microsystems). Metaphase spreads were processed on the basis of the Leica MCK software and presented as multicolour karyograms. 　 Q-band analysis was performed at Chromocentre (Japan). After quinacrin staining, 20 cells from each sample were randomly selected and the normality of chromosomes was analysed. Five different independent lines of STAP stem cells showed no chromosomal abnormalities in Q-band analysis after >10 passages.

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●「三胚葉由来組織に共通した万能性体性幹細胞の探索」 概要　 　小保方晴子 / 2010年12月

体性幹細胞は、成体の体内に実際に存在し、生体の恒常性を保つため老化細胞の代替となる若い細胞を生み出し、炎症などの生体反応に応答して失われた細胞を補充する役割を担っていると考えられている。現在までに、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞は多種の分化可塑性を有する体性幹細胞として研究が進められている。また、前駆細胞との区別が難しいが、各種生体組織にはそれぞれの組織幹細胞が存在していると考えられており、多くは培養系においてその存在が認められている。間葉系幹細胞研究に代表されるように、体性幹細胞の研究は発生学的な観察に基づき展開されている。哺乳類の発生において三胚葉分化は決定的な過程であり、体性幹細胞の多くも三胚葉分化の後に存在が確認されることから、三胚葉分化が起こった後は、例えば外胚葉系組織に存在している幹細胞が中胚葉や内胚葉由来組織の細胞に分化する、中胚葉系に存在している細胞が外胚葉・内胚葉由来組織の細胞に分化すると言った、いわゆる胚葉を超えた分化は起こりえないと考えられている。しかし近年、分子生物学的解析手法の発展により間葉系幹細胞の一部は外胚葉系の細胞から構成されることや、間葉系幹細胞が生体内で神経形成に関与するなどといった、いわゆる胚葉を越えた分化が三胚葉形成の後にも起こっていることが報告されている。これらの報告により、体性幹細胞の起源や分化能の限界についての大前提に疑問がもたれるようになってきている。 　 Vacantiらは2000年に、全身の生体の組織内には三胚葉由来によらず非常に強いストレスに耐性を有するspore-like stem cellが存在し体性幹細胞の補充に寄与している可能性を提唱してきた。その後、他の研究グループからも同様な概念に基づいた研究報告が相次いでいる。2002年には骨髄中に万能性幹細胞MAPCが存在することが報告され、2004年には間葉系幹細胞の一部に分化万能性を有するMIAMI cellが存在することが報告され、2006年には造血幹細胞の小さいサイズの分画の中にVSELS cellsが存在することが報告され、2010年には間葉系細胞の一部にストレス耐性のmuse cellsが存在することが報告されている。本研究では、spore-like stem cellの仮説を証明する第一歩として、全身の組織に共通の性質を持つ幹細胞が存在することを証明することを目標とし、幹細胞の採取、解析、再生医療研究応用への可能性を検討した。第一章では、生体組織由来のpluripotent stem cellに関する研究の動向を概説し、本研究の背景をまとめると共に、本研究の意義及び目的を明らかにした。 　 第二章では、spore-like stem cellの採取法を検討すると共に、幹細胞マーカーの発現を解析した。Spore-like stem cellsは細胞直径が非常に小さいという特徴を有しているため、小さい細胞を採取する方法を施行した。まず、cell sorterを用いてBlack6 マウスの骨髄細胞から、直径6μｍ以下の細胞のみを回収した。続いて低浸透の溶液で細胞を短時間処理することによって、大きな細胞の細胞膜を破壊し小さな細胞のみを回収した。また先端を10μｍほどまで細めたガラスピペットで細胞を粉砕することによって小さい細胞を回収した。それぞれの方法で回収した細胞群を無血清培地で培養を行うと浸透圧処理または粉砕処理によって回収された細胞群から浮遊した球形のコロニー形成(以降sphereと呼ぶ)が確認された。粉砕処理を行った場合、高頻度にsphere形成が観察された。sphere形成の数は年齢依存的であり、生後4週齢のマウスからは生後8週齢のマウスの約二倍の数が観察された。 　 Sphere形成は幹細胞の強い自己複製増殖能の結果として現れる現象であると考えられているため、免疫染色により、幹細胞マーカーの発現解析を行った。まず間葉系幹細胞や造血幹細胞など広範な体性幹細胞に発現が報告されているc-kitとSca-1の発現を調べた結果、多くのsphereに発現が確認された。続いてES細胞や発生初期の受精卵に発現が観察される万能性幹細胞マーカーであるSSEA-1とE-cadherinの発現を調べた結果、これらも多くのsphereに発現が確認されることが明らかとなった。 　 タンパク質レベルでの万能性幹細胞マーカーの発現が確認されたことから、遺伝子レベルでの万能性幹細胞マーカーの発現をES細胞の遺伝子発現と比較して検討を行った。特に、タンパク質レベルでのマーカーの発現強度は個々のsphereによって異なっていたため、個々のsphereは異なる遺伝子発現パターンを示すのではないかと言う予想の下、sphere一つ一つを顕微鏡下で採取し遺伝子発現の解析を行った。その結果、Oct4, Nanog, Sox2, Ecat1, Cripto, Esg1など万能性幹細胞に特異的に発現が見られる遺伝子マーカーが高頻度に発現していることが分かった。 　 第三章では、これらの細胞の分化能をin vitro, in vivoの双方で調査した。ES細胞から三胚葉由来の細胞へ分化させるための培養条件を参考に、培養条件を設定し分化誘導実験を行った。その結果、sphere由来の細胞は神経・筋肉・肝実質細胞などの代表的な三胚葉由来組織細胞へ分化できることが確認された。生体内での分化能と増殖能を検討するために移植実験を行った。Sphereの細胞はPGA上に播種され、2-3日PGA(poliglycolic acid)上に細胞を接着させるために培養した後、NOD/SCIDマウスの皮下に移植した。4-6週間後に移植片を採取し、組織学的、免疫組織化学的に解析を行った。移植後直径3ｍｍほどのカプセル化した塊を形成した。内部には上皮、神経、筋肉、管といった三胚葉由来すべての組織形成が確認された。以上の結果から、粉砕処理後にsphereを形成する細胞は、無血清条件下で培養すると、非常に幼弱なタンパク質・遺伝子を発現し、培養系、生体内双方において三胚葉系由来組織への分化能を有することが示された。 　 第四章では同様の細胞群がその他の組織にも存在しているかを確認するため三胚葉由来組織の代表的な組織である脊髄(外胚葉)、筋肉(中胚葉)、肺(内胚葉)から細胞を単離し、粉砕処理後、無血清培養条件下で浮遊培養を行った。タンパク質マーカーの発現は骨髄で行ったときと同様にc-kit, Sca-1, SSEA-1, E-cadherin陽性の細胞が確認された。遺伝子発現解析の結果、骨髄のときと同様、ES細胞に特異的な遺伝子の発現が多数確認された。特に肺由来のsphereからは高頻度にOct4陽性のsphere細胞塊が確認された。一方、脊髄からは多くのsphere形成が確認されるが、Oct4などのES細胞特異的な遺伝子マーカーを発現したsphereの割合は骨髄由来のsphereと比較して低い値を示した。培養系での分化誘導実験を行うと、骨髄のときと同様に、各特異的なマーカーで陽性を示す三胚葉由来組織の細胞へと分化した。さらにPGAに播種しNOD/SCIDマウスの皮下に移植すると、骨髄のときと同様に上皮、神経、筋肉、軟骨、腺といった三胚葉系の組織へと分化した。以上のことから、骨髄中から発見された広範な分化能を有する細胞群は、脊髄、筋肉、肺といったすべての三胚葉由来組織からも単離され得ることが確認された。 　 第五章では、幹細胞の万能性を証明するための最も重要な証明方法であるキメラマウスの作成を幼弱神経幹細胞培養条件であるbFGF, LIF依存浮遊培養系によって培養したsphereを用いて試みた。ICRマウスの受精卵とsphereを用いた凝集法によってキメラ卵を作成し、24時間培養した後、子宮に移植した。20日後に産まれた新生児の毛皮にはsphere由来の毛が観察されなかった。また産まれてきた新生児の数は移植した受精卵の数よりも少なかった。キメラの胎生致死、もしくは特定の組織への貢献、もしくは低頻度での貢献の可能性が考えられたため、胎生12.5日目の胎児の解析を行った。その結果全身にsphere由来の細胞が散在していることが確認された。このことから、sphere由来の細胞は全身の組織形成に寄与できる能力を有していることが明らかとなった。 　 第六章では本研究の総括と展望について述べた。本研究ではこれまでの常識を超えた体性幹細胞の起源と分化可能性についての新しい学説をもとに、体性幹細胞の創生の可能性を探る実験を試みた。本研究で得られた幹細胞が実際に生体内に存在するかどうかは、これから明確にすべき大きな課題である。しかしながら培養法をさらに効率化することによって大量培養を可能とし、組織工学をはじめとする再生医療研究の新たな細胞ソースとして期待できる。また、これまでiPS細胞を始めとした万能性幹細胞の創生の研究が盛んに行われているが、再生医療研究に必要なのは安全に機能する体性幹細胞であり、万能性幹細胞からの体性幹細胞の分化誘導は難しい。そこで本研究の第四章で検討したような体性幹細胞を体細胞から創出する試みが成功すれば細胞生物学的にも発生学的にも非常にインパクトのある研究成果となり、再生医療応用に最も適した細胞ソースを提供できるようになるものと期待される。

●早稲田大学大学院先進理工学研究科 / 博士論文審査報告書 　 「三胚葉由来組織に共通した万能性体性幹細胞の探索」 申請者 / 小保方晴子

体性幹細胞は、生体の恒常性を保つため、 老化細胞の代替となる若い細胞を生み出し、炎症などの生体反応に応答して失われた細胞を補充する役割を担っていると考えられている。現在までに、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞は多種の分化可塑性を有する体性幹細胞として研究が進められている。また、前駆細胞との区別が難しいが、各種生体組織にはそれぞれの組織幹細胞が存在していると考えられており、多くは培養系においてその存在が認められている。間葉系幹細胞研究に代表されるように、体性幹細胞の研究は発生学的な観察に基づき展開されている。哺乳類の発生において三胚葉分化は決定的な過程であり、体性幹細胞の多くも三胚葉分化の後に存在が確認されることから、三胚葉分化が起こった後は、例えば外胚葉系組織に存在している幹細胞が中胚葉や内胚葉由来組織の細胞に分化する、あるいは中胚葉系に存在している細胞が外胚葉・内胚葉由来組織の細胞に分化するなど、いわゆる胚葉を超えた分化は起こりえないと考えられている。しかしながら、近年、分子生物学的解析手法の発展により間葉系幹細胞の一部は外胚葉系の細胞から構成されることや、間葉系幹細胞が生体内で神経形成に関与するなど、いわゆる胚葉を超えた分化が三胚葉形成の後にも起こっていることが報告されている。これらの報告により、体性幹細胞の起源や分化能の限界についての大前提に疑問がもたれるようになってきている。　 Vacanti らは、2000年に、全身の生体の組織内には三胚葉由来によらず非常に強いストレスに耐性を有するspor e -l ike s tem c e ll が存在し体性幹細胞の補充に寄与している可能性を提唱した。その後、他の研究グループからも同様な概念に基づいた研究報告が相次いだ。2002年には骨髄中に万能性幹細胞MAPCが存在することが報告され、2004年には間葉系幹細胞の一部に分化万能性を有するMIAMI c e l l が存在することが報告され、2006年には造血幹細胞の小さいサイズの分画の中にVSELS c e ll s が存在することが報告され、2010年には間葉系細胞の一部にストレス耐性のmus e c el ls が存在することが報告されている。　 本論文では、spor e- l ike s t em c e ll の学説を証明する第一歩として、全身の組織に共通の性質を持つ幹細胞が存在することを証明することを目標とし、幹細胞の採取、解析、再生医療研究応用への可能性を検討している。以下に各章の審査概要を述べる。　 第1章では、生体組織由来のpluripot ent s t em c el l に関する研究の動向を概説し、本論文の背景をまとめると共に、本論文の意義及び目的を明らかにしている。　 第2章では、spor e- l ike s t em c e ll の採取法を検討すると共に、幹細胞マーカーの発現を解析した結果をまとめている。spor e- l ike st em c e ll は細胞直径が非常に小さいという特徴を有しているため、大きい細胞塊を壊して小さい細胞を採取する必要がある。そこで、低浸透圧の溶液で細胞を短時間処理する方法、および先端径10μm程度のパスツールピペットで吸引と吐出を繰り返して細胞を粉砕する方法を考案し、小さな細胞のみの回収に成功している。これらの手法を用いて、マウスの骨髄から回収された微小な細胞群を無血清培地で培養すると、浮遊した球形のコロニー(以降sphereと呼ぶ)が形成されることを見出している。特に、粉砕処理を行った場合、高頻度にsphere形成が観察されることを明らかにしている。つぎに、間葉系幹細胞や造血幹細胞など広範な体性幹細胞に発現が報告されているc -kit とSca-1、およびES細胞や発生初期の受精卵に発現が観察される万能性幹細胞マーカーであるSSEA-1とE- cadhe rin の発現を調べた結果、いずれも多くのsphereで発現が確認されたことを報告している。さらに、個々のsphereを顕微鏡下で採取し遺伝子発現解析を行った結果、万能性幹細胞に特異的に発現が見られるOct4, Nanog, Sox2, Ecat1, Cr ipt o, Es g1 などの遺伝子マーカーが高頻度に発現していることも確認している。これらの実験結果は、sphere形成が幹細胞の強い自己複製増殖能の結果として現れる現象であることを支持するものであり、sphereが特殊な幹細胞の集合体であることを物語る極めて意義深い成果である。　 第3章では、sphereの分化能をin vi t ro およびin vivo の双方で調査した結果をまとめている。ES細胞から三胚葉由来の細胞へ分化させるための培養条件を参考に、培養条件を設定し分化誘導実験を行った結果、sphere由来の細胞は神経・筋肉・肝実質細胞などの代表的な三胚葉由来組織細胞へ分化できることを確認している。続いて、生体内での分化能と増殖能を検討するために移植実験を行っている。細胞を接着させるためにPGA(po ly glyc ol i c ac id) 上で2-3日間培養した後、sphereをNOD/SCIDマウスの皮下に移植し、4-6週間後に組織学的、免疫組織化学的な解析を行った結果、直径3mm程度の内腔構造を持つ塊の形成を確認し、内部には上皮、神経、筋肉、管といった三胚葉由来すべての組織形成が起こっていることを明らかにしている。以上の結果は、粉砕処理後にsphereを形成する細胞は、無血清条件下で培養すると、培養系、生体内双方において三胚葉系由来組織への分化能を有することを示しており、非常に幼弱なタンパク質・遺伝子を発現している事実と併せて考えると、幹細胞の中でもES細胞に近い分化万能性を有することを示唆する興味深い知見である。　 第4章では、同様の細胞群がその他の組織にも存在しているかを確認するための種々の実験結果をまとめている。三胚葉由来組織の代表的な組織である脊髄(外胚葉)、筋肉(中胚葉)、肺(内胚葉)から細胞を単離し、粉砕処理後、無血清培養条件下で浮遊培養を行い、タンパク質マーカーの発現および遺伝子発現解析を行っている。その結果、骨髄と同様に、c-kit, Sca-1,SSEA-1,E-cadhe r in 陽性の細胞が確認され、またES細胞に特異的な遺伝子の発現が多数確認されることを見出している。つぎに、培養系での分化誘導実験を行うと、骨髄の場合と同様に各特異的なマーカーで陽性を示す三胚葉由来組織の細胞へと分化することを確認している。さらに、PGAに播種しNOD/SCIDマウスの皮下に移植すると、骨髄の場合と同様に上皮、神経、筋肉、軟骨、腺といった三胚葉系の組織へと分化することも確認している。以上の結果から、骨髄中から発見された広範な分化能を有する幹細胞群は、脊髄、筋肉、肺といったすべての三胚葉由来組織を粉砕して形成されるsphereからも取得できることが示され、全身の組織に共通の性質を持つ幹細胞の存在が強く示唆された。　 第5章では、sphereを用いて、幹細胞の万能性を証明するための最も重要な証明方法であるキメラマウスの作成を試みた結果をまとめている。ICRマウスの受精卵とsphereを用いた凝集法によってキメラ卵を作成し、24時間培養した後、子宮に移植した結果、20日後に産まれた新生児の毛皮にはsphere由来の毛が観察されず、 新生児の数は移植した受精卵の数よりも少なかったことを報告している。キメラマウスの胎生致死、あるいは特定の組織へのキメラの偏在という可能性が考えられたため、胎生12.5日目の胎児の解析を行った結果、全身にs phe re由来の細胞が散在していることを確認している。以上の結果は、sphere 由来の細胞は、増殖速度は遅いものの全身の組織形成に寄与できる能力を有していることを示している。　 第6章では本論文の総括と展望について述べている。　 本論文では、これまでの常識を超えた体性幹細胞の起源と分化可能性についての新しい学説をもとに、体性幹細胞の創生の可能性を探る実験の結果をまとめたものである。本研究でES細胞に近い分化万能性が認められた幹細胞が実際に生体内に存在するかどうかは、これから明確にすべき大きな課題である。しかしながら培養法をさらに効率化することによって大量培養を可能とし、組織工学をはじめとする再生医療研究の新たな細胞源として期待できる。また、これまでiPS細胞をはじめとした万能性幹細胞の創生の研究が盛んに行われているが、再生医療研究に必要なのは安全に機能する体性幹細胞であり、万能性幹細胞からの体性幹細胞の分化誘導は難しい。そこで本研究の第4章で検討したような体性幹細胞を体細胞から創出する試みが成功すれば細胞生物学的にも発生学的にも非常にインパクトのある研究成果となり、再生医療応用に最も適した細胞ソースを提供できるようになるものと期待される。よって、本論文は博士(工学)の学位論文として価値あるものと認める。